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A proteína adesiva vitronectina (75 kDa) ocorre no fluido sanguíneo humano de uma cadeia (Vn 75) ou uma forma de duas cadeias (Vn 6510), e é produzido por uma clivagem específica (em Arg 379 ndashAla 380), por uma proteinase não identificada até agora. Estas duas formas mostraram-se funcionalmente diferentes e, portanto, esta clivagem pode ter um significado regulatório in vivo. Aqui, relatamos o uso de uma Vn recombinante de cadeia única adaptada, uma fosforilação de proteína quinase A específica em Ser 378. e análise de seqüência para mostrar: (1) que nenhuma das proteinasas originárias de sangue, anteriormente pensado para ser a proteinase endógena (Plasmina, trombina, tPA e uPA), é de fato a convertase in vivo e (2) a furina, uma serina endoproteinase que reside na via secretor dos hepatócitos, onde Vn é sintetizada, especifica especificamente o Vn no local da clivagem endógena. Consequentemente, propomos que a conversão Vn 75 a Vn 6510 tenha lugar no fígado (não no sangue) e é realizada por furina. 1 Introdução A Vitronectina (Vn) foi descoberta como um estudo de dispersão de lsquoserum 1, no entanto, agora é considerado não apenas uma importante glicoproteína adesiva na matriz extracelular e no sangue circulante, mas também um participante importante em uma grande variedade de outras substâncias biológicas funções. Estes incluem anexação, disseminação e migração de células, coagulação do sangue, ativação do plasminogênio, fibrinólise e regulação da função do complemento (2º e 5). Vn está presente no fluido sanguíneo humano em concentrações de 200ndash400 mugml e, portanto, constitui 0.2ndash0.5 das proteínas plasmáticas totais. Os níveis plasmáticos reduzidos de Vn foram relatados em pacientes com insuficiência hepática grave, sugerindo que o fígado é a principal fonte de Vn no plasma 6,7. No sangue circulante, o Vn é encontrado em duas formas moleculares: uma forma de uma cadeia de 75 kDa (Vn 75) e uma forma cortada (Vn 6510) composta por duas cadeias (65 e 10 kDa) mantidas juntas por uma ponte dissulfureta 8. As duas formas parecem ser o produto de genes distintos, que diferem em um único aminoácido na posição 381. A metionina nessa posição dá origem à forma de V75, enquanto a treonina dá origem a uma clivagem in vivo (em Arg 379 ndashAla 380 ), E produz a forma Vn 6510 9. Uma vez que a evidência foi apresentada para mostrar que Vn é segregada de células Hep G2 como uma glicoproteína de cadeia única 10. pareceu razoável supor que essa clivagem ocorre no fluido sanguíneo. Várias proteinases sanguíneas foram propostas para realizar a clivagem Arg 379 ndashAla 380, no entanto, nenhuma delas foi rigorosamente demonstrada (por análise de sequência) para ser a proteinase endógena que realiza a clivagem in vivo. Conseqüentemente, o locus da clivagem endógena não foi estabelecido inequivocamente. O nosso interesse em estabelecer a identidade desta proteinase endógena decorreu da nossa descoberta de que esta clivagem endógena produz uma forma funcionalmente distinta de Vn. Por exemplo, descobrimos que, em condições fisiológicas, o Vn 6510 tem maior afinidade pela heparina 11. e uma dependência de heparina diferente na sua fosforilação pela proteína quinase A (PKA) 12. Aqui mostramos que a furina, uma serina endoproteinase que reside na via secretor dos hepatócitos, cliva este vínculo seletivamente, e propõe que a conversão de Vn 75 a Vn 6510 tenha lugar no fígado (antes da secreção) e não no sangue, como sugerido Até agora. 2 Materiais e métodos 2.1 Químicos e enzimas Os seguintes materiais foram adquiridos nas fontes comerciais: heparina Sepharose, plasmina e alfa-trombina da Sigma gamma-32 PATP (3000 Cimmol) e 35 Smethionine das membranas de nitrocelulose Amersham de Schleicher e Schuell t - PA e u-PA foram adquiridos da N-glicanase recombinante de Calbiochem a partir de diagnósticos de Genzyme, a furina foi adquirida de Affinity Bioreagents (ABR). 2.2 Outras proteínas e enzimas Vn foram purificadas a partir de plasma humano recentemente congelado como descrito anteriormente 8 com as modificações usadas rotineiramente em nosso laboratório 11,13. A subunidade catalítica de PKA foi purificada de acordo com o método descrito por Beavo 14. 2.3 Expansão e purificação Vn recombinante O Vn (Thr-381) foi expresso como descrito anteriormente 15. A proteína expressa foi coletada a partir do meio de células infectadas com High-5 e carregada numa coluna de agarose de heparina previamente equilibrada com TrisndashHCl NaCl 50 mM 150 mM (pH 7,5), tudo em 4degC. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e as fracções foram eluídas por um gradiente de 150 mM a 1 M de NaCl em TrisndashHCl (pH 7,5). As fracções eluídas foram analisadas por imunotransferência e por coloração com prata. As amostras do pico foram reunidas e concentradas no dispositivo de filtro de membrana centrífuga (Millipore), produzindo um Vn puro (Thr-381) puro e concentrado (0.5ndash1 mgml, conforme determinado pelo teste de proteína Pierce). 2.4 Clivagem de Vn (Thr-381) por várias proteinases sanguíneas (trombina, plasmina, u-PA ou por t-PA). A mistura reaccional (180 milh) continha os seguintes constituintes nas concentrações finais indicadas: Vn (27 ml) , Tampão de HEPES (50 mM), pH 7,5 e uma das proteinases como se segue trombina (17,5 Uml), plasmina (1,7 ml), u-PA, t-PA (200 UI em 240 mul). Cada reação permitiu prosseguir a 37 ° C por períodos indicados na figura figurativa apropriada. 2.5 Clivagem de Vn (Thr-381) por furina A mistura reaccional (volume total 100 mul) continha os seguintes constituintes nas concentrações finais indicadas: Vn (Thr-381) (20 ml), tampão HEPES (100 mM), pH 7,5 , CaCl2 (2 mM), beta-mercaptoetanol (1 mM), octil-beta-D - glucopiranosido (0,1) e furina (100 Uml). A reacção foi conduzida a 30 ° C por 20 h. As alíquotas foram removidas e analisadas por fosforilação de PKA (que ocorre especificamente em Ser 378) e SDSndashPAGE com coloração com azul de Coomassie para identificar os produtos de clivagem. As condições experimentais utilizadas para a clivagem foram adotadas a partir de 16. Deve notar-se que a incubação prolongada com Vn foi necessária para obter a extensão da clivagem necessária para a análise dos produtos de clivagem, presumivelmente devido ao fato de que a enzima que usamos é uma Proteína recombinante e, como tal, pode não ser otimamente dobrado. Pode também ser devido ao fato de que a furina reside na célula em um meio membranal que não possamos simular adequadamente em solução aquosa. 2.6 Fosforilação de Vn (Thr-381) por PKA A mistura de ensaio de fosforilação (50 mul) continha os seguintes constituintes nas concentrações finais indicadas: Vn (Thr-381) (11 ml), a subunidade C de PKA (3 ml) , Acetato de magnésio (20 mM), PATP gamma 32 (10 muM 6 Cimmol), tampão HEPES (20 mM, pH 7,5) e heparina (10 ml). Realizou-se a reacção prosseguir à temperatura ambiente durante 30 min e foi detida pela adição de 17 μl de tampão de amostra de Laemmlis 4 vezes concentrado e por ebulição durante 3 min. Posteriormente, as amostras foram submetidas a SDSndashPAGE, os géis foram então secos e expostos à radiografia. 2.7 Análise Western Blots de Vn (Thr-381) As manchas foram testadas com anti-soro policlonal alfa-Vn, seguido por IgG anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano. As bandas foram visualizadas pela ECL. 2.8 A sequenciação da banda de 10 kDa produzida pela clivagem de furina de Vn (Thr-381) Vn de clivagem de furina (Thr-381) foi executada em 12,5 PAGE previamente pré-executada durante 10 min usando 5% de tioglicolato de sódio no tampão corrente. O gel foi transferido para uma membrana de PVDF usando um aparelho de transferência húmida Bio-Rad. As bandas foram visualizadas por coloração clara de azul de Coomassie (em 50 metanol e 5 ácido acético, durante 5 minutos e 10 minutos), seguida de descoloração em 50 metanol. A banda de 10 kDa, excisada da membrana seca, foi sequenciada em um seqüenciador de proteína Procise 491, da Applied Biosystems. 2.9 Preparação do mutante de Vn (1ndash379) e do mutante de Vn (S378A) O mutante de Vn (1ndash379) foi gerado inserindo um codão de parada após R 379. Aproveitando os dois sites de Msc1 (332 pares de bases par) uma PCR O fragmento foi gerado utilizando um oligonucleótido de sentido a montante do primeiro local Msc1 e um oligonucleótido anti-sentido a jusante do segundo sítio Msc1 que continha uma inserção de codão de parada TAA (sublinhada). A sequência de oligonucleótidos anti-sentido foi: 5prime-GGA TGG CCA CGT GCG GGA TGG CCG-3prime. O produto da PCR foi digerido com Msc1 e subclonado em Vn (Thr-381) - pRSET digerido com Msc1. A mutação pontual S378A em Vn foi gerada por amplificação por PCR usando o cDNA Vn (Thr-381) (em pGEX 2T) como um modelo. O oligonucleótido de sentido foi: 5prime-TCC CGC CGG CCA GCC CGC GCC-3prime. O oligonucleótido anti-sentido concebido a partir do vector-pGEX 2T foi: 5prime-CGT CAG TCA GTC ACG ATG AAT TC-3prime. Os fragmentos amplificados por PCR purificados digeridos com Nae I e Eco RI foram ligados em Vn (Thr-381) - pGEX-2T digerido com Nae I e Eco RI. Ambas as construções foram sequenciadas para confirmar que a amplificação estava correta, antes de uma subclonagem adicional no vetor de transferência PVL 1393 (sites Bam HI e Eco RI). A recombinação forçada no DNA viral e outros procedimentos para a expressão foram realizados como descrito anteriormente 15. 3 Resultados e discussão 3.1 Expressão, caracterização e purificação do Vn (Thr-381) usado neste estudo Para identificar a proteinase endógena que prende Vn na ligação Arg 379 ndashAla 380, preparamos um Vn recombinante contendo Thr na posição 381 (Vn (Thr-381)), como no precursor fisiológico da forma de duas cadeias de Vn. Este Vn recombinante (MW sim70 kDa (Fig. 1A)) foi expresso em células de insecto High-5 e segregado no meio de crescimento usando seu próprio péptido sinal. Verificou-se que a proteína segregada era uma proteína de cadeia única, com um tamanho molecular reduzido (70 em vez de 75 kDa) provavelmente devido a uma glicosilação incompleta nas células de insetos. De fato, após a deglycosylation enzimática, tanto a Vn (Thr-381) que preparamos, quanto a forma de uma cadeia de Vn (75 kDa) isolada do plasma, foram encontradas para migrar em comum ao lado (Fig. 1B). Portanto, o Vn recombinante que contém um resíduo Thr na posição 381 e não é cortado nas células High-5 é um substrato adequado para a identificação da proteinase endógena que cliva Vn na sua ligação Arg 379 ndashAla 380. O Vn (Thr-381) recolhido a partir de meio de células de alta 5 infectadas foi purificado numa coluna de agarose de heparina, e as fracções eluídas foram analisadas por imunotransferência e por coloração com prata e mostrou-se pura (Fig. 1C). As amostras das fracções de pico foram reunidas e concentradas para 0.5ndash1 mgml como descrito na Secção 2. Purificação e caracterização de Vn (Thr-381) expressa em um sistema de baculovírus. (A) Expressão de Vn (Thr-381) em células de insecto High-5: Vn foi expresso em células High-5 infectadas com baculovírus. Amostras de meio contendo Vn segregado (Thr-381) foram analisadas por imunotransferência utilizando anticorpos policlonais Vn anti-humanos. Vn (Thr-381) (pista 3) de células High-5 não infectadas (pista 2) e Vn purificado a partir de plasma humano (pista 1). (B) Deglycosylation do plasma Vn, e de Vn (Thr-381) expresso em células High-5. Meio de uma amostra contendo Vn segregado (Thr-381) (pista 1), ou uma amostra de Vn (pista 2), purificada a partir do plasma. As amostras (0,5 caneca de cada uma) foram desnaturadas a 56 ° C durante 15 min, depois tratadas com 1 U de N-glicanase em tampão Tris 100 mM, pH 8,6 (mistura de reacção total 100 mil) durante 2 h a 37 ° C. As amostras foram analisadas por imunotransferência usando anticorpos policlonais Vn anti-humanos. (C) Purificação de Vn (Thr-381) expressa em células de insecto High-5. Vn (Thr-381) recolhido a partir de meio de células infectadas de High-5 foi carregado numa coluna de agarose de heparina previamente equilibrada com TrisndashHCl 50 mM NaCl50 mM (pH 7,5), tudo a 4 ° C. Em seguida, a coluna foi lavada com o mesmo tampão e as fracções foram eluídas por um gradiente de 150 mM a NaCl 1 M num tampão TrisndashHCl (pH 7,5). As alíquotas das fracções indicadas foram fervidas (5 min no tampão de amostra de Laemmlis) e carregadas em SDSndashPAGE (10 acrilamida). Os géis foram analisados por coloração com prata (gel superior) e por imunotransferência com anticorpos policlonais anti-Vn (gel inferior). P, coloque em w, lave. 3.2 Vn (Thr-381) não é clivado por proteinases encontradas no sangue Com base no PM aproximado dos produtos de clivagem obtidos do plasma Vn por algumas proteinases basofílicas, assumiu-se que a plasmina, tPA ou uPA pode ser a proteinase endógena natural responsável Para a clivagem da ligação Arg 379 ndashAla 380 em Vn. A identificação e caracterização desta proteinase endógena atraiu ainda nossa atenção quando descobrimos que as formas de uma cadeia e duas cadeias de Vn diferem em suas propriedades de uma maneira que pode implicar uma diferença em sua função fisiológica 11,12 e ter uma Papel regulatório distinto no sangue. Se assim for, a proteinase pode até constituir um alvo farmacológico interessante. A determinação do locus em que esta divisão ocorre (o sangue em si como assumido até agora, ou o fígado onde a síntese de Vn é conhecido por ter ocorrido) também é importante a esse respeito. Na nossa busca pela proteinase endógena, utilizamos: (1) um Vn recombinante de cadeia única contendo Thr na posição 381 (Vn (Thr-381)) como no precursor natural da forma Vn de duas cadeias, bem como um Vn truncado no sítio endógeno (Vn (1ndash379) e um Vn (Vn (S378A) mutado de um único local) (2) a fosforilação seletiva de Ser-378 com PKA (3) a sequência de consenso para o local de clivagem de cada proteinase e (4) uma determinação rigorosa do local de clivagem exata de cada proteinase suspeita por sequenciação de aminoácidos ou por espectrometria de massa dos produtos de clivagem e não apenas pela determinação do tamanho molecular aproximado do (s) produto (s) de clivagem usando SDSndashPAGE. Mostrou que a plasmina cliva o Vn encontrado no fluido sanguíneo na ligação Arg 361 ndashSer 362 produzindo um fragmento marcado de 12 kDa 17. Contudo, consideramos a possibilidade de que todo o Vn clivável no sangue com um Thr na posição 381 já tenha sido cortado e Que a clivagem de plasmina no Arg 3 61 ndashSer 362 que produziu o fragmento marcado com radiofrequência de 12 kDa representa a clivagem de plasmina das moléculas de Vn com um Met na posição 381 (para investigar a possibilidade de que a plasmina também se cliva em Arg 379 ndashAla 380. precisávamos de uma cadeia Vn com Thr a Posição 381 (Vn (Thr-381)). Se a plasmina clivar este Vn em Arg 379 ndashAla 380. devemos obter uma banda radiactiva de 2 kDa do fosfopéptido 361ndash379, em vez do fragmento de 12 kDa do segmento 362ndash459 (ver Esquema 1A para predição de tamanho). Apresentação esquemática dos locais de clivagem e localização dos fragmentos proteolíticos gerados após exposição a proteinases do fluido sanguíneo e subsequente fosforilação com PKA em Ser 378. (A) Os produtos de clivagem de Vn gerados após clivagem de plasmina ou trombina. Com base nos locais de clivagem já conhecidos pela plasmina 17 e pela trombina 18., prevemos que os fragmentos radiomarcados do Vn clivado (Thr-381) utilizados neste estudo devem ser: um fragmento marcado com radiografia de 12 kDa contendo resíduos 362ndash459 se a plasmina não Divide-se no local de clivagem endógeno (Arg 379 ndashAla 380) e um fragmento marcado com radio de 2 kDa correspondente aos resíduos 362ndash379 se a plasmina também cliva neste local. Da mesma forma, com base nos locais conhecidos de clivagem de trombina em Vn, esperávamos obter um fragmento marcado com 17 kDa originário do segmento 305ndash459 em Vn, se a trombina não escasse o sítio de clivagem endógeno (ou seja, a ligação Arg 379 ndashAla 380), E apenas um fragmento de 7 kDa correspondente aos resíduos 305ndash379 em Vn, se a trombina clivar este site. (B) Os produtos de clivagem de Vn gerados após a sua digestão com furina. Se a furina clivar Vn na ligação Arg 379 ndashAla 380, esperamos gerar um fragmento radiolabled de 60 kDa correspondente ao segmento 1ndash379, que deve conter o Ser 378 fosforilado com PKA. FIG. 2 representa a exposição de Vn (Thr-381) a quatro proteinases que são ativadas no sangue. É claramente evidente que, enquanto a plasmina e a trombina clivam Vn (Thr-381) (Fig. 2A, B), u-PA e t-PA não o clivam (Fig. 2C). Quando Vn (Thr-381) é exposto à plasmina para aumentar os períodos de tempo e depois submetido a fosforilação por PKA, formam-se um produto recortado sim12-kDa que se verificou ser marcado radioactivamente por ATP marcado radioactivamente e PKA (Fig. 2A. Superior painel). A fosforilação de Vn por PKA mostrou anteriormente ser específica do local com Vn isolada do plasma 12. No entanto, isso foi reconfirmado aqui com o substrato recombinante usado em nosso estudo, pela demonstração de que quando Ser-378 é mutado para Ala, é Não fosforilado pelo PKA (Fig. 2A, B). Uma vez que na clivagem com plasmina o radiomarcador é encontrado no pequeno fragmento (12 kDa), podemos concluir que a plasmina não corta Vn na ligação Arg 379 ndashAla 380 uma vez que o local de fosforilação Ser 378 precede esta ligação (ver Esquema 1). Identificação dos produtos de clivagem de Vn após a digestão por proteinasas provenientes de fluidos sanguíneos. (A) Monitoramento da clivagem de plasmina. Vn (Thr-381) ou o mutante Vn (S378A) foram digeridos com plasmina (para detalhes, ver Seção 2). Os produtos de clivagem foram revelados pela fosforilação de PKA (um local em Vn em Ser 378) que foi realizado a 22 ° C durante 30 min na presença de PATP 32 gamma. A reacção foi terminada por ferver durante 5 minutos no tampão de amostra de Laemml e carregando em SDSndashPAGE (10 acrilamida). Os géis foram secos e expostos a autorradiografia (gel superior) ou transferidos para membranas de nitrocelulose e transferidos (gel de fundo) utilizando anticorpos policlonais anti-Vn humanos. (B) Monitoramento da digestão da trombina. Vn (Thr-381) foi digerido pela trombina (para detalhes, veja a Seção 2). Os produtos de clivagem foram revelados como descrito em A. (C) Monitoramento da digestão de u-PA e t-PA. Vn (Thr-381) foi digerido por u-PA ou t-PA (para detalhes, veja a Seção 2). Os produtos de clivagem foram revelados como descrito em A. Mostramos anteriormente que a trombina cliva Vn em Arg 305 ndashThr 306. e em Arg 370 ndashAsn 371 18. Se a trombina clivar Vn também no local de clivagem endógeno (Arg 379 ndashAla 380), nós Esperaria obter uma banda radiada de 7 kDa originária do segmento 305ndash379 (ver Esquema 1A). De fato, esse péptido marcado foi formado (Fig. 2B. Painel superior). No entanto, a análise por espectrometria de massa dos fragmentos clivados indicou que este péptido foi formado como resultado de um local adicional de clivagem de trombina (em Arg 444 ndashSer 445. Não relatado anteriormente), que produz um péptido radiomarcado 371ndash444. 3.3 Furin cliva selectivamente a ligação Arg 379 ndashAla 380 em Vn Tendo em vista o fato de que nenhuma das proteases de plasma testadas foi capaz de clivar Vn no local de clivagem endógena, consideramos a possibilidade de que a proteinase possa cortar Vn já durante sua produção em o fígado. Consideramos esta possibilidade, apesar de os relatórios anteriores indicarem que o Vn é segregado das células do hepatoma na sua forma de cadeia simples (MW de 75 kDa 10). Esta reconsideração baseou-se em outro relatório a partir do qual se poderia deduzir que durante a produção de Vn em Hep G2, ambas as formas de Vn (a cadeia única (Vn 75) e a forma de duas cadeias (Vn 6510) são segregadas 19. Além disso, Uma observação semelhante também foi feita em nosso laboratório (Z. Gechtman e S. Shaltiel, resultados não publicados). Em vista do acima, tentamos estabelecer se a clivagem de Vn em Arg 379 ndashAla 380 ocorre no fígado antes da secreção, por exemplo, por um membro da família hepática de proenzimas convertasas (PC), que são conhecidos por residir em A via secretor dos hepatócitos. O candidato proteinase escolhido foi furina, pelas seguintes razões: (1) anteriormente, mostrou-se altamente expresso em células Hep G2 e em hepatócitos normais 20. e residir na rede trans Golgi, onde ele cliva uma grande variedade de proenzimas 21 (2) está comercialmente disponível de forma recombinante e, o mais importante, (3) a sua especificidade é mais adequada para provocar a clivagem endógena de Vn a R 376 PSR darr A 380. Deve notar-se que a sequência de consenso mínima para a clivagem de furina é RXXR darr 16. é encontrada em três locais diferentes em Vn (R 361 SQR darr G 365. a R 376 PSR darr A 380. e em R 431 TRR darr V 435). No entanto, em um estudo que examina as sequências de vários substratos proteicos processados constitutivamente por furina, verificou-se que a clivagem em R darr A possui uma alta preferência. Por exemplo, de 34 proteínas precursoras processadas por furina, 10 foram clivadas em um local de ArgndashAla, apenas duas foram clivadas em um local de ArgndashGly e nenhuma foi cortada em um local de ArgndashVal 22. Aproveitando a fosforilação de PKA específica de Vn em S 378. e o fato de que a sequência de consenso ideal para a clivagem de furina é em R 376 PSR darr A 380. esperamos que, se a furina for de fato a proteinase endógena, a clivagem de Vn (Thr-381) produziria um produto rotulado radioactivamente com um MW de sim60 kDa (o rótulo radioativo originário de S 378). Como visto na Fig. 3A (pistas 2 e 3), este é realmente o caso: o produto de clivagem obtido co-migrou com o mutante truncado Vn (1ndash379). Para obter uma identificação rigorosa do local de clivagem, buscamos o produto de clivagem sim10 kDa (não rotulado) que também deve ser formado como resultado da clivagem de furina para ordená-lo e estabelecer inequivocamente o local de clivagem. Para isso, submetemos a mistura de reação a SDSndashPAGE e a coloração com azul de Coomassie, com foco nos produtos MW baixos (l30 kDa). Como visto na Fig. 3B após clivagem com furina, obtivemos duas bandas (I e II). A banda I teve exatamente a sequência correspondente ao N-terminal livre que deve ser formado como resultado da clivagem endógena (Tabela 1). Além disso, muitas vezes observamos uma banda adicional (Banda II na Fig. 3B. Pista 2). A quantidade relativa de Band II variou de uma experiência para outra e nossas tentativas de identificar positivamente sua estrutura falharam até agora. Contudo, descobrimos que ele tem um N-terminal bloqueado e, portanto, mesmo que seja originário de Vn, não pode ser originado da proximidade do local de clivagem endógena (ver Esquema 1). Furin cliva Vn na ligação Arg 379 ndashAla 380, produzindo o Vn 6510. O Vn recombinante (Thr-381) foi digerido por furina durante 20 h a 30 ° C. Os produtos de clivagem foram revelados (A) por fosforilação de PKA (como descrito na Fig. 2) e (B) pela coloração com azul de Coomassie, comparando as bandas de baixo MW de Vn (Thr-381). Os produtos do Vn digerido com furina (Thr-381) (pista 2, A e B) foram comparados com Vn (Thr-381) incubados em condições idênticas, mas sem furina (pista 1, A e B) e ao Vn ( 1ndash379) mutante truncado, no qual um codão de parada foi inserido após o local de clivagem endógeno, para produzir o segmento polipeptídico 1ndash379 (A, pista 3). Tabela Tabela 1. Análise de sequência da banda de 10 kDa resultante da clivagem de Vn (Thr-381) por furina O rendimento foi muito baixo para a determinação quantitativa devido à labilidade do triptofano durante a hidrólise ácida. 3.4 Observações finais Os resultados apresentados neste relatório mostram que nenhuma das proteinases de soro anteriormente propostas para clivar a ligação Arg 379 ndashAla 380 é a proteinase endógena (todas elas se fragmentam na proximidade dessa ligação, mas não na ligação em si). No entanto, a furina, uma serina endoprotease dependente de cálcio que reside na via secretor dos hepatócitos, cliva esta ligação especificamente e pode ser assim a proteinase endógena responsável pela clivagem fisiológica da cadeia única na forma de duas cadeias de Vn. Com base nestes achados, propomos que a conversão Vn 75 a Vn 6510 tenha lugar no fígado antes da secreção, não no sangue, como sugerido até agora. Este achado prepara o cenário para obter uma visão mais profunda do significado fisiológico (possivelmente regulatório) da conversão de Vn 75 a Vn 6510 e identifica uma enzima alvo potencial para intervenção farmacológica. Reconhecimentos S. S. é o titular da cadeira Kleeman em Bioquímica. Esta pesquisa foi apoiada pela Israel Science Foundation. Artigo Informações Formato disponível Texto completo: HTML PDF FEBS Letters 480 (2000) 1873-3468 copy 2015 Federação de Sociedades Bioquímicas Europeias Vitronectin Furin Proteína adesiva Fibrinólise Heparina Matriz Extracelular História da Publicação Issue on-line: 30 de agosto de 2000 Versão do registro on-line: 30 de agosto de 2000 Manuscrito Aceito: 28 de julho de 2000 Manuscrito Revisado: 26 de julho de 2000 Manuscrito recebido: 26 de maio de 2000 Referências Conteúdo relacionado Artigos relacionados ao que você está visualizando Por favor, ative o Javascript para ver o conteúdo relacionado a este artigo.
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